Pierwsza cerkiew w Zamościu powstała w roku1589 dla kupców greckich przybyłych z Konstantynopola do budującego się miasta. Kolejna, murowana powstała dzięki Tomaszowi Zamojskiemu w roku 1631. W roku 1874 powstaje cmentarz prawosławny głównie dla potrzeb dużego garnizonu rosyjskiego. Posiadał drewnianą kaplicę cmentarną rozebraną w roku 1938 i właśnie na jej miejscu w latach 1986-1992 powstała niewielka, murowana cerkiew pod wezwaniem św. Mikołaja Cudotwórcy.
Obok świątyni zachowały się groby rosyjskich generałów, wysokich oficerów i duchownych. Cerkiew znajduje się na nowym osiedlu Zamościa przy ulicy Gen. Mikołaja Bołtucia.