Początki kościoła sięgają przełomu XVI i XVII wieku, kiedy to znajdująca się w tym miejscu drewniana kapliczka popadła w skrajną ruinę. W 1603 roku, tutejsze tereny wizytował jeden z biskupów i zalecił jej rozebranie. Wtedy to rozpoczęto starania związane z wybudowaniem nowej świątyni. Większość środków na postawienie nowego kościoła przekazała córka marszałka koronnego - Gertruda z Bnia Opalińska. Była ona małżonką Jana Firleja, właściciela majątku w niedalekiej Dąbrowicy.
Akt erekcyjny wystawiono 24 maja 1608r. w Krakowie przez biskupa krakowskiego ks. Piotra Tyleckiego. Budowę zlecono Piotrowi Durie z Wenecji. Ta rozpoczęła się w 1608 roku i trwała dwa lata. Kościół został konsekrowany 12 czerwca 1611 przez biskupa kijowskiego księdza Krzysztofa Kazimierskiego. Kościół Świętego Ducha w Markuszowie należał do kościołów szpitalnych, czyli takich, gdzie wraz ze świątynią znajdował się najczęściej mały szpitalik dla ubogich. Utrzymywany był głównie z datków i darowizn jakie przekazywała okoliczna ludność. Jednakże ze względu na zubożenie społeczeństwa, a co się z tym wiąże brak środków na działalność kościoła, już w latach 40-50-tych XVII wieku popadł on w ruinę.
W ciągu następnego wieku były wykonywane tylko doraźne prace, mające zabezpieczyć kościół przed kompletnym zawaleniem. Całości dopełnił pożar, który wybuchł pod koniec 1811 roku, kiedy to spłonęła większa część wsi wraz z kościołem. Został on odbudowany ok. 1820 roku, dzięki staraniom ówczesnego właściciela Markuszowa hrabiego Tarnowskiego, jednakże w 1896 miejscowość nawiedził kolejny pożar, który doszczętnie zniszczył szpital, oraz w znacznym stopniu uszkodził kościół. Został on odbudowany w tym samym roku. Obecnie msze święte odprawiane są w nim tylko w niedziele w okresie od 1 maja do 31 października.